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npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 57 (2023) この記事を引用

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18 オルトメトリック

メトリクスの詳細

微生物細胞に損傷を与える可能性のあるストレス因子が数多く存在するため、洗練されたストレス応答メカニズムが進化しました。 既存のバイオレポーターは個々の反応を監視できますが、生きた微生物の多峰性ストレス反応を検出するセンサーはまだ不足しています。 RGB-S レポーターと呼ばれる単一のプラスミドに組み合わされた、直交的に検出可能な赤、緑、青の蛍光タンパク質により、生理的ストレスを報告する 3 つのプロモーター (RpoS の場合は PosmY) を使用した大腸菌の転写応答の同時、独立したリアルタイム分析が可能になります。 ）、遺伝毒性（SOSの場合はPsulA）、細胞毒性（RpoHの場合はPgrpE）。 バイオレポーターは、標準分析およびその後のトランスクリプトーム分析と組み合わせた蛍光活性化細胞分類 (FACS) と互換性があります。 バイオテクノロジーに関連する 2-プロパノールを含むさまざまなストレッサーは、1 つ、2 つ、または 3 つすべてのストレス反応を活性化し、ストレスに関連しない代謝経路に大きな影響を与える可能性があります。 共焦点蛍光顕微鏡イメージングによるマイクロ流体培養に実装された RGB-S レポーターにより、生きたバイオフィルムの時空間分析が可能になり、不均一なストレス応答を持つ細菌の層別亜集団が明らかになりました。

変化する環境条件下で生存を確保するために微生物がどのように適応変化を仲介するかを理解するには、対応するストレス応答経路をモニタリングする必要があります。 RpoS、SOS、および RpoH は、広範囲のストレス刺激を通じて転写経路を調節する重要なストレス応答経路であり、バイオフィルムの形成と増殖 1,2、病原体の毒性 3、抗生物質耐性 4、進化 4、および生態学的競争 5 に影響を及ぼします。 RpoS は、大腸菌 (E. coli) の約 500 個の遺伝子を直接的および間接的に制御する代替シグマ因子です6。 一般的なストレス反応として知られる RpoS 活性化は、生理的ストレスの指標として主に飢餓によって刺激されます 7。 一方、SOS 応答は、化学的、物理的、または生物学的因子によって引き起こされる DNA 損傷に応答していくつかの機能を担う 50 以上の遺伝子で構成されています 8。 したがって、SOS 応答の上方制御は細胞の遺伝毒性と関連しています。 代替シグマ因子 RpoH は、大腸菌における熱ショック ストレス応答の重要な調節因子であり、30 を超える遺伝子が含まれています 9,10。 RpoH 応答の活性化は、細胞毒性の指標として細胞内で折り畳まれていないタンパク質が蓄積することによって刺激されます。

これらの生物学的プロセスが技術や医療と高い関連性を持っていることを考慮すると、根底にある分子機構を包括的に理解することが非常に重要です。 例えば、複数のストレッサーに対する細胞応答をモニタリングすることは、生成物阻害、栄養素剥奪、pH、せん断応力 12 などの細胞生存率と生産性 11 を理解することや、除草剤や除草剤などのさまざまな環境毒性物質をモニタリングすることに重要な貢献をすることができます。抗生物質13． したがって、微生物のストレス応答の多峰性解析は、基礎研究だけでなくバイオテクノロジーのプロセスにとっても重要となるでしょう。

この目標に向けて、いくつかの遺伝的にコード化された細菌バイオセンサーが開発されています12、13、14、15、16、17、18。 一般的に使用されるレポーター要素は、比色β-ガラクトシダーゼ (lacZ)15 および生物発光 (luc、lux)16 レポーターです。 これらのシステムは通常、オンライン測定やマルチカラーレポートを制限する細胞溶解、多段階アッセイ、または触媒反応を必要とするため、ストレス応答の分析用に蛍光ベースのレポーターが開発されてきました17、18。 しかし、現在利用可能なシステムには、生細胞の多峰性応答を高い時空間分解能で報告する機能がありません。 ここでは、対応するストレス応答経路のモニタリングを通じて、生理学的ストレス、遺伝毒性、および細胞毒性に対する細菌の応答を同時に表示する、遺伝的にコード化された3色蛍光バイオセンサーについて説明します（図1および補足図1）。